En este estudio se determinó el efecto inhibitorio de dos concentraciones de nisina (16,7 y 10,0 mg/kg) sobre la población de Staphylococcus aureus presente en el queso blanco fresco tipo "telita" almacenado en refrigeración (8 ± 2 oC) durante 4 semanas. El queso "telita" sin nisina fue utilizado como control. Se analizaron muestras a las semanas 0, 1, 2, 3 y 4 de su almacenamiento, se les determinó la población de S. aureus, la actividad de agua y el pH siguiendo la metodología oficial... Los recuentos de S. aureus en el queso recién elaborado (tiempo cero) fueron significativamente diferentes eentre los lotes. Se observó un incremento de la población de microorganismo con el tiempo de almacenamiento en las muestras control. La nisina redujo significativamente (p<0,05) el número de células viables a las 2 semanas de almacenamiento, la disminución fue 0,77; 0,56; 0,82 y 0,59 unidades logarítmicas en los lotes AIII, BI, BII y BIII, respectivamente. El efecto inhibitorio de la nisina sobre el S. aureus fue dependiente de la cantidad de nisina agregada y de la carga microbiana inicial del microorganismo presente en el queso. Se concluye que la adición de nisina al queso "telita" disminuye la supervivencia de S. aureus por lo cual podría ser utilizado como un agente antimicrobiano de origen natural que mejoraría la calidad microbiológica del queso blanco fresco elaborado siguiendo las buenas practicas de manufactura (BPM).
Palabras clave: Queso "telita", Staphylococcus aureus, nisina, bacteriocinas, queso fresco.
In this study, the inhibiting effect of two concentrations (16.7 and 10.0 mg/kg) of nisin on the population of Staphylococcus aureus present on fresh "telita" cheese stored at 8 ± 2 oC for one month was determined. "Telita" cheese without nisin was used as control. Using the official methodology, the population of S. aureus, the water activity, and the pH were determined to the samples taken at weeks 0, 1, 2, 3 and 4 of storage. Nisin significantly decreased (p<0.05) the number of viables cel at 2 weeks storage time, the decrease was 0.77; 0.56; 0.82 y 0.59 log units in AIII, BI, BII y BIII, respectively. An increase in the population of the microorganism with storage time was observed in the control samples. The inhibiting effect of nisin on S. aureus depended on the amount of nisin added to the product and of the initial microbial load of the microorganism originally present in the cheese. It is concluded that the addition of nisin to the "telita" cheese decreases the survival of S. aureus, and therefore it could be used as an antimicrobial agent of natural origin that would improve the microbiological quality of fresh cheese made following good manufacturing practices (GMP).
Key words: "Telita" cheese, Staphylococcus aureus, nisin, bacteriocins, fresh cheese.
Departamento de Procesos Biológicos y Bioquímicos. Universidad Simón Bolívar.
En los últimos años los quesos blancos frescos han estado involucrados en brotes de enfermedades transmitidas por alimentos, atribuible principalmente al empleo de leche cruda como materia prima, a deficientes condiciones higiénicas durante la manufactura, transporte y almacenamiento, lo que aunado a las condiciones intrínsecas del producto, tales como su pH y actividad de agua, favorecen la subsistencia y multiplicación de los microorganismos presentes en el queso reduciendo así la vida útil del producto (1-3).
Según la Oficina Pan Americana de salud (OPS), el S. aureus ha sido el agente etiológico responsable del 35,3% de los brotes reportados en América Latina y el Caribe entre 1993 y 2002, y del 53,2% de los brotes reportados e investigados en Venezuela para el mismo período, siendo los quesos blancos el alimento principalmente involucrado (4-6).
Estudios sobre la calidad microbiológica de los quesos blancos frescos venezolanos de elaboración artesanal, indican que en más del 98% de las muestras analizadas, las poblaciones de S. aureus están por encima de los límites aceptables. Como se mencionó antes, en la elaboración de los quesos blancos frescos se emplea leche cruda y en muchos casos hay fallas en las buenas prácticas de manufactura (BPM). Lo que explica que estos productos sean riesgosos para la salud de los consumidores (7,5,8), y sean el alimento involucrado en brotes de intoxicaciones alimentarias (5).
El Centro Experimental de Recursos Autóctonos (CEDRA), una empresa privada que surge para iniciar el llamado Plan para el Fortalecimiento del Sector Lácteo en el Municipio Piar, Upata, Edo. Bolívar, se planteo el propósito de mejorar la calidad del queso "telita", extender su vida útil y mejorar asi su comercialización, con tal fin se construyó una red de cooperación científica en Upata, Estado Bolívar, financiada por Fonacit. Entre los logros de dicha red están la optimización de la tecnología del proceso de elaboración, el establecimiento de las características físicas, químicas y microbiológicas del queso blanco fresco tipo "telita" y la implementación de medidas para prolongar la vida útil del producto. Para este último fin se propuso el uso de la nisina, una bacteriocina producida por ciertas cepas de Lactococcus lactis que inhibe la bacterias Gram positivas, incluyendo microorganismos patógenos como S. aureus (9-11). Además, la nisina es atóxica, estable, se inactiva por las enzimas del tracto digestivo del humano y su uso en productos lácteos se permite en más de 50 países (9,12,13). El objetivo de esta investigación fue determinar el efecto inhibitorio de la nisina sobre la población de S. aureus presente en el queso "telita" almacenado a 8°C durante 4 semanas.
El queso "telita" de manufactura artesanal se elaboró en la quesera "Virgen del Valle" en Upata, Estado Bolívar, se empleó un sistema piloto semiautomático con una cuba de 1000 L de capacidad, el cual fue desarrollado por CEDRA y se siguió el siguiente procedimiento La leche cruda de vaca se sometió al proceso de formación de la "cuajada" por calentamiento y adición de cuajo comercial y suero ácido. Una vez formada la "cuajada", se eliminó el suero mediante sucesivos cortes de dicha cuajada, se le añadió sal previamente disuelta en agua tibia (50ºC), y en un recipiente adecuado, denominado caldero, se calentó dicha "cuajada", hasta conseguir la textura que caracteriza al queso "telita" (hilado). A la pasta formada se le eliminó el aire mediante formación de pliegues sucesivos, se cortó y se colocó en moldes para darle la forma característica y se empacó. El queso fresco elaborado con leche cruda se debe almacenar en refrigeración durante su comercialización y hasta su consumo.
Para la realización de este estudio se prepararon un total de 9 lotes de queso "telita" empleando 3 partidas de leche cruda que se identificaron como I, II, y III. La procedencia de la leche cruda identificada como I y II era un centro de acopio cercano al sitio de elaboración del queso, mientras que la de la partida III era de una finca cercana. La leche cruda se calentó hasta 34°C, se formó la "cuajada", utilizando cuajo comercial (enzimas de Mucor miehei), marca comercial Taurus, sin especificación técnica, y suero ácido que provenía del desuerado de una preparación de queso previa. La "cuajada" se separó en 3 lotes de 6 kg cada uno, identificados como A, B y C. A cada uno de estos lotes se agregó sal (4-5%), a dos de ellos se agregó nisina (Chrisin E234, CHR HANSEN- Dinamarca. Al lote A de cada producción de quesos se le agregó nisina a una concentración de 16,7 mg/kg, para así obtener AI, AII, AIII (serie A). Al lote B, se le agregó nisina a una concentración de 10,0 mg/kg y se obtuvieron los lotes BI, BII, BIII (serie B). Al lote C no se agregó nisina y se utilizó como control, obteniéndose CI, CII, CIII (serie C). Se procedió a la cocción de la pasta hasta alcanzar la textura de hilado (80-90°C), con posterior paleteo y moldeado final. De cada uno de los lotes, se tomaron muestras de quesos que se almacenaron a 8 ± 2°C, y analizaron a los tiempos 0, 1, 2, 3, y 4 semanas. Se les determinó el recuento de S. aureus por duplicado, y el pH y actividad de agua (aw) por triplicado.
De cada lote de queso "telita", se pesaron 11 g de muestra (14), se diluyeron en 99 mL de citrato de sodio al 2% y se homogeneizaron en un Stomacher (LAB-BLENDER mod. 400) por 1 min. Se prepararon las diluciones correspondientes en agua peptonada al 0,1% y se sembró 1 mL de cada una de dichas diluciones, por duplicado, en la superficie de placas con agar Baird Parker, BP (Difco), adicionado de emulsión de yema de huevo al 40% y telurito de potasio al 3,5%. Las placas se incubaron a 37°C por 48 h y se contaron las colonias con las características típicas de S. aureus. Se confirmó su presencia mediante tinción Gram y la prueba de coagulasa (14,15). Los resultados se expresaron como ufc/mL.
Actividad de agua aw y pHPara la determinación del aw se utilizó el Decagon CX-2, mientras que para el pH se empleó un pHmetro digital (Hanna mod. HI-9321). Las determinaciones se hicieron por triplicado y se reportó la media de los resultados.
Los resultados obtenidos se sometieron a un análisis de varianza multifactorial (ANOVA) y una prueba de intervalos múltiples de Duncan, utilizando el programa estadístico STATGRAPHICSÒ Plus para Windows, versión 5.1.
En la Figura 1 y 2 se presenta la sobrevivencia del S. aureus en aquellas muestras a las cuales se le añadió 16,7 mg/kg (serie A) y 10,0 mg/kg (serie B), respectivamente. En el Cuadro 1 se presenta los valores de las poblaciones S. aureus en cada una de las muestras analizadas durante el almacenamiento. Los recuentos de S. aureus en el queso recién elaborado (tiempo cero) fueron significativamente diferentes entre lotes. La nisina redujo significativamente (p<0,05) el número de células viables a las 2 semanas de almacenamiento, sin recuperación en los lotes AI y AII, y disminuyendo en 0,77; 0,56; 0,82 y 0,59 unidades logarítmicas en los lotes AIII, BI, BII y BIII, respectivamente (Cuadro 1). En las muestras que no contenían nisina CI, CII y CIII se observó un incremento de la población de S. aureus en el orden de un ciclo logarítmico al finalizar el almacenamiento (Cuadro 2 y Figura 2). En el Cuadro 2 se presentan los valores de aw y pH de dichas muestras. En las muestras de queso donde la población inicial de S. aureus es del orden de 102 ufc/g, la población microbiana al final del almacenamiento no excedió el recuento inicial del queso (Cuadro 1), lo que demuestra que la nisina fue un efectivo biopreservador.
Las concentraciones de nisina empleadas mostraron un efecto bacteriostático sobre S. aureus a las 2 semanas de almacenamiento a 8 ± 2ºC y dicho efecto fue dependiente de la concentración de nisina adicionada al producto, asi como también de la población inicial de S. aureus presente en el queso. En los lotes de la serie A (16,7 mg de nisina/kg) la reducción alcanzó 2 unidades logarítmicas cuando la población inicial del microorganismo fue hasta 2,0 log ufc/g, ello refleja una pérdida de la viabilidad de S. aureus del 90% y 99% para los lotes AI y AI, respectivamente. Para el lote AIII, con una población inicial de S. aureus de 4,93 log ufc/g, la reducción del microorganismo fue de 0,77 unidades logarítmicas, con una pérdida de la viabilidad del 83%. En los lotes de la serie B, la reducción fue 0,56; 0,82 y 0,59 unidades logarítmicas para BI, BII y BIII, respectivamente, con una disminución de la viabilidad del 73%, 85% y 74%, respectivamente, en el mismo período de tiempo.
La contaminación de S. aureus puede significar una calidad deficiente de la materia prima y/o una inadecuada manipulación de la misma durante el proceso, sin descartar la posible contaminación post proceso. La diferencia en los resultados obtenidos en los 3 lotes de queso elaborados de la partida de leche III se debió a que esta leche no se almacenó bajo refrigeración antes de su uso, su temperatura de recepción era de aproximadamente 30°C. La temperatura de leche de las partidas I y II fue 8° C. Los recuentos de los 3 lotes de producción de los quesos preparados con la partida III están por encima de los límites microbiológicos (<102 ufc/g) indicados en las normas oficiales de México y Nicaragua (16,17). Se tomaron estas referencias ya que en Venezuela todavía no existe una normativa oficial que establezca los límites microbiológicos para quesos blancos frescos. Los altos recuentos iniciales de S. aureus en algunos de los lotes de queso analizados evidencian que puede existir un potencial riesgo a la salud de los consumidores. El incremento de la población de S. aureus en el orden de un ciclo logarítmico al finalizar el almacenamiento en muestras sin nisina indica que el microorganismo puede crecer en el queso tipo "telita" aun refrigerado, existiendo mayor probabilidad de que lo haga a temperatura ambiente, la cual es la condición comúnmente usada para almacenar el queso "telita". Estudios previos revelan que el S. aureus puede estar presente en productos lácteos almacenados en refrigeración, a temperaturas menores de 10ºC (10,11,18), sin producir enterotoxina (11,18). Condiciones de abuso de temperatura y/o almacenamiento de los quesos frescos a temperatura ambiente, sumado al hecho de que los valores de aw y pH de esos productos permiten el crecimiento de microorganismos patógenos (Cuadro 2), hacen a los quesos frescos un riesgo para la salud del consumidor. El S. aureus puede crecer y producir enterotoxina en un rango de pH entre 4,0 y 9,80 y un aw mayor de 0,86 (19).
La reducción del número de células viables durante las 2 primeras semanas del almacenamiento en los quesos que contenian nisina (series A y B) y con un incremento significativo de la población de S. aureus después de ese periodo de almacenamiento, fue similar a lo observado por Laukova et al. (10) en productos lácteos a los cuales se les inoculó Listeria monocytogenes en presencia de la enterocina CCM 423. La respuesta de los microorganismos frente a bacteriocinas se refleja en una disminución del recuento de células viables durante el inicio del almacenamiento con posterior recuperación de la población del microorganismo reto. Los microorganismos se pueden hacer resistentes a la bacteriocina, pero también la acción proteolítica de las enzimas presentes puede degradarla. En productos lácteos se pudiera presentar una interacción entre la grasa y la nisina con pérdida de su actividad (13,20,21). En el queso "telita" la temperatura de cocción del queso está entre 80-90°C, ello sumado a que el pH del queso varió entre 5,4 y 5,9 (Cuadro 2), pudieron ser factores inhibitorios de la actividad de la nisina. Se ha reportado que a pHs menores de 7 la nisina pierde entre un 20% a 45% de su actividad (13,9,22). El número de células de S. aureus recuperadas al final del almacenamiento fué menor en las muestras control, para todos los lotes analizados.
Se concluye que la adición de nisina al queso "telita" disminuye la supervivencia de S. aureus por lo cual podría ser utilizado como un agente antimicrobiano de origen natural que mejoraría la calidad microbiológica del queso blanco fresco elaborado. El efecto observado es dependiente de la concentración de la nisina agregada y de la carga microbiana inicial del producto. El uso de la nisina no puede sustituir las buenas prácticas de manufactura (BPM) necesarias para la elaboración de un queso fresco artesanal.
Solicitar copia a: Elba Sangronis. Edificio QYP, Ofic. 121 Sartenejas, Baruta. Apartado Postal 89000. e-mail: esangron@ usb.ve
Financiamiento de FONACIT: Red de Cooperación Productiva de Queso "telita", Nro. 20010001864.